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gene bridges反選擇BAC修飾工具包

更新時間:2013-03-28 09:23:33點擊次數:3762次字號:T|T
反選擇BAC修飾工具包 使用反選擇盒進行高級BAC修飾,同樣適用于細菌染色體。 手冊[PDF]????聯系技術支持????????????訂單???????????序列 特點 ?????&n

反選擇BAC修飾工具包

使用反選擇盒進行高級BAC修飾,同樣適用于細菌染色體。

手冊[PDF]    聯系技術支持            訂單           序列

特點

          快速BAC修飾(2-3周)

          高效Red/ET重組

          Red/ET質粒易于消除

          效率遠高于pScB-neo系統

應用

          片段交換

          無需留下選擇標記或任意多余序列,即可進行標記插入和刪除。

          引入短序列,如點突變、loxP位點、限制性位點等。

          同樣適用于細菌染色體修飾及普通ColE 1起點質粒

非選擇基因的兩步交換綜述

1.    Red/ET轉化BAC宿主

第一步,Red/ET質粒pSC101-BAD-gbaA轉入含BAC的大腸桿菌宿主。

2.Red/ET第一步
通過添加阿拉伯糖,保持溫度變化在30°C37°C之間,可誘導介導Red/ET的基因表達。誘導后,細胞為電穿孔做好準備,添加同源臂的PCR產品(rpsL-neo PCR產品反選擇/選擇盒)電穿孔。

3.修飾后BAC DNA的選擇及提取

選擇攜帶修飾后BAC的克隆。只有攜帶修飾成功的BAC的克隆才能通過瓊脂板上的卡那霉素選擇。之后進行DNA微量制備,用于確認反選擇/選擇盒的成功融合。

4. Red/ET第二步
通過添加阿拉伯糖,保持溫度變化在30°C37°C之間,可誘導介導Red/ET的基因表達。誘導后,細胞為電穿孔做好準備。非選擇DNA既可以是含選擇盒左右同源臂及點突變的寡核苷酸(對照反應),也可以是側帶同源臂的基因,將被電穿孔。rpsL-neo反選擇/選擇盒將被非選擇DNA替換。

5.無反選擇/選擇盒的選擇

只有選擇/反選擇盒被非選擇DNA片段替換的克隆才會在鏈霉素板上生長。隨后DNA微量制備,用于確認反選擇/選擇盒的成功融合。

說明

這是基于鏈霉素選擇的新版反選擇盒pRpsL-neo。本工具包用于在2-3周內使用反選擇盒修飾任意類型的細菌人造染色體(BAC)。內含反選擇盒pRpsL-neo基于鏈霉素選擇,表現出遠高于pSacB-neo或其他可比系統的效率。

工具包也可用于操作細菌染色體核普通ColE 1起點質粒。本工具包Red/ET效率高,重組完成后Red/ET重組蛋白表達質粒pRedET易于消除。

目錄

          Red/ET重組蛋白表達質粒pRedET。通過該質粒轉化,任意大腸桿菌株都可作為Red/ET專用

          已攜帶Red/ET質粒的BAC宿主大腸桿菌株DH10B

          用于您自己實驗的pRpsL-新霉素模板

          陽性對照,在150kb BAC中引入點突變

          詳細操作指南,質粒、遺傳圖、序列說明

           

序列

rpsL-kanR/neoR selection cassette選擇盒

rpsL-kanR/neoR選擇盒

 

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