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gene bridges快速簡易BAC修飾工具包

更新時間:2013-03-28 09:16:31點擊次數:4792次字號:T|T
快速簡易BAC修飾工具包 適用于所有類型的BAC修飾。 手冊[PDF] ???聯系技術支持???????????? 訂單??????????? 序列 特點 ????????

快速簡易BAC修飾工具包

適用于所有類型的BAC修飾。

手冊[PDF]    聯系技術支持             訂單            序列

特點

          快速、可靠克隆大型DNA分子

          在選擇的位置進行精確的DNA修飾

          獨立限制性位點

          無大小限制

應用

          簡單的BAC修飾,如插入選擇標記、刪除帶有選擇標記基因的片段、插入功能片段和選擇標記基因等。

一步插入選擇標記基因綜述

1.Red/ET BAC轉化
第一步,Red/ET質粒pSC101-BAD-gbaA轉入包含BAC的大腸桿菌宿主。


2. Red/ET BAC修飾


通過添加阿拉伯糖,溫度變化保持在30°C至37°C,可誘導介導Red/ET的基因表達。在誘導完成后,細胞為電穿孔做好準備,添加有同源臂的PCR產品進行電穿孔。


3. 修飾后BACDNA選擇及提取

選擇由PCR產品中可選標記運送的抗生素抗性,以識別攜帶修飾成功的BAC的菌落。之后進行DNA微量制備,用于確認是否實現需要的BAC修飾。

說明

本工具包使用創新Red/ET重組技術修飾BAC。該技術可以在2周內對任意類型BAC進行插入和刪除。
Red/ET重組采用體內重組與校正活性來將構筑中的多余突變最小化。工具包內含修飾BAC的必需物和進行對照試驗所需的全部材料,旨在讓您熟悉這一新技術。

另外,本工具包還提供可將任意大腸桿菌株轉化為用于Red/ET重組應用的菌株的載體。pSC101-BAD-gbaAtet與四環素抗性盒一起提供。本盒包含一個僅能在30°C繁殖的溫度敏感型復制起點(ori),在37°C時質粒就會消失。這樣,當不再需要時,就可以進行簡單的質粒消除。

要引入突變(如本工具包所含新霉素抗性盒這樣的選擇盒),您首先需要將同源序列引入選擇盒。這可以通過簡單的PCR反應完成。
您可以自由選擇這些短同源序列(每個50nt)用于實驗。您只需選擇修飾位置,直接使用Red/ET重組技術在目標核苷插入選擇盒。PCR產品需要在細菌中使用Red/ET重組系統進行電穿孔。
在Red/ET重組成功后,修飾后的DNA可以使用傳統DNA微量制備方法恢復。

目錄

          pSC101-BAD-gbaA(tet)是基于pSC101 ori(溫度敏感型起點)的Red/ET表達質粒的衍生物。

          BAC宿主攜帶pSC101-BAD-gbaA(tet)

          修飾150kb BAC的陽性對照實驗(攜帶pSC101-BAD-gbaA的宿主中的BAC克隆,用于BAC骨干中刪除的neo PCR產品,宿主中作為陽性重組體的BAC-neo克?。?

          操作指南,質粒、遺傳圖和寡核苷酸序列的說明


序列

Tn5-kanR/neoR selection cassette 選擇盒

Tn5-kanR/neoR選擇盒

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