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PHAGOBURST試劑盒使用說明

更新時間:2013-02-01 14:59:24點擊次數:3566次字號:T|T
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PHAGOBURST,PHAGOBURST代理,PHAGOBURST銷售,PHAGOBURST公司,PHAGOBURST產品,PHAGOBURST價格

1.       試劑盒簡介

PHAGOBURST試劑盒,用于定量檢測全血中白細胞氧化爆發功能。試劑盒中包括未標記的調理大腸桿菌,PMAfMLP作為刺激物(可三選一進行實驗),DHR123作為熒光底物。樣本經過刺激物的刺激后,吞噬細胞在氧化爆發過程產生的氧化物可將DHR123轉化為R 123。采用流式細胞儀檢測產生氧化反應產物的吞噬細胞百分比和酶活力(每個細胞含有的R 123的量)。

試劑盒可以考察藥物是否引起機體細胞氧化爆發活性改變。氧爆活性的降低或者缺失在慢性肉芽腫?。ò准毎δ苋毕荩┲锌梢员挥^察到。另外,氧爆活性的降低還可以在AIDS病人,老年人,發生嚴重感染的病人,采用已酰半胱氨酸進行治療的病人,或者骨髓移植,輸血的病人被觀察到。

試劑盒不僅適用于人的血樣,同樣也適用于大小鼠,兔,狗,牛及其他種屬。

2.       材料和試劑

2.1 試劑盒包括以下試劑

REAG A( 試劑A)

1x洗液:將1整瓶REAG A粉末溶解在1L的雙蒸水中。

REAG B(試劑B

1瓶(2mL),1x濃度的穩定且未標記的調理大腸桿菌(E.coli),大約為1-2x109個菌/mL。

REAG C(試劑C

1瓶(100 μL)chemotactic petide fMLP (200x儲備液濃度,1mM)。每5 μL加在1mL的 1x洗液中進行稀釋。

REAG D(試劑D

1瓶(100 μL) phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  (200x儲備液濃度,1.62 mM)。每5 μL加在1mL 1x洗液中進行稀釋。

REAG E(試劑E

共有12瓶基質試劑。每瓶內有1片含dihydrorhodamine 123(DHR123)的基質片,使用前20-30 min用1mL的 1x洗液進行溶解。

REAG F(試劑F

1瓶(20 mL)的裂解液(10x儲備液濃度)。在使用前用雙蒸水按1:10進行稀釋,配制成1x的裂解液,用于裂解紅細胞和固定白細胞。

REAG G(試劑G

1瓶(20 mL),1x濃度的DNA染液(粉色溶液),用于流式細胞儀分析時區別細菌和白細胞。

 

儲存條件和穩定性:試劑盒需要在2-8℃避光條件。使用前將大腸桿菌(REAG B)充分渦旋混勻或者用針抽吸使其分散。fFMLP和PMA的工作溶液在使用后即棄。試劑內含有防腐劑,但是不會影響氧化爆發活性的檢測。試劑的有效期同試劑盒包裝上標明一致。

2.2    試劑盒未包括以下材料,但需要準備

l  血液采集用的肝素化抗凝管。

12x75 mm的一次性試管(BD公司的Falcon管,貨號:352052)和合適數量的試管架。

500 mL1000 mL的試劑瓶,用于保存1x洗液和1x裂解液。

l  帶蓋的冰浴盒。

l  雙蒸水或者注射用水,用于配制1x洗液和1x裂解液。

l  合適量程的移液器(20-200 μL, 100-1000 μL),一次性槍頭。

l  連續加樣器和槍頭。

l  水浴鍋。

l  數字式溫度計。

l  渦旋器

l  冷凍離心機(配有12x75 mm的吊杯)。

488 nm激發波長(氬離子激光)的流式細胞儀。

3.       操作過程

2.1 準備

l  配制1x洗液。

l  根據需要按比例配制試劑C fMLP)或者試劑D PMA

l  根據測試的樣本量配制1x裂解液(試劑F, 2mL/測試樣。

l  在使用基質溶液(試劑E)的20-30 min前對其進行配制,加入1mL 1x洗液后輕輕搖勻,勿渦旋振蕩。配制后未使用的基質溶液可在小于-15℃的條件下保存2周。

l  準備冰浴。

l  預熱水浴鍋至37,溫度必須精確控制!

l  開啟流式細胞儀,用校準微球(beads)進行校準。

3.2    樣本處理

3.2.1          加樣

將肝素化抗凝的全血渦旋混勻后,在5 mL試管(Falcon管)底部各加100 μL全血,將所有試管放入冰浴中10 min,使血樣降低溫度至0。

注意:勿將血液殘留在試管壁上。不要使用EDTA或者檸檬酸抗凝管采集全血。

3.2.2          激活

l  在tube#1 中加入20 μL的1x洗液(REAG A),標記為“陰性對照”管。

l  在tube#2中加入20 μL預冷后渦旋混勻的大腸桿菌(REAG B)。

l  在tube#3 中加入20 μL的fMLP稀釋后的工作溶液(REAG C),標記為“低刺激對照”管。

l  在tube#4 中加入20 μL的PMA稀釋后的工作溶液(REAG D),標記為“高刺激對照”管。

l  所有試管再次混勻后,置于37°C水浴內孵育10 min。孵育時間和溫度必須嚴格監控,水浴箱必須蓋住

3.2.3          氧化

每支試管中均加入20 μL 基質溶液(REAG E),徹底渦旋混勻,在37°C水浴箱內孵育10 min。

3.2.4          裂解和固定

每支試管加入2 mL預熱至室溫的1x 裂解液(REAG F),渦旋混勻,室溫避光孵育20 min。離心(5 min,250xg,2-8°C),去除上清液。

3.2.5          洗滌

每支試管加入3 mL 1x洗液(REAG A),渦旋混勻,離心細胞(5 min,250xg,2-8°C)。去除上清液。

3.2.6          DNA染色

每支試管加入200 μL DNA染液(REAG G),混勻,避光冰浴10 min后,在30 min內完成流式細胞儀分析。

4.       流式細胞儀分析

采用藍綠激發光的488nm的氬離子激光器。

l  設定1gateFL2的直方圖(紅色熒光),圈定含有人類二倍體細胞相同DNA的細胞群(用于排除細菌,見英文原版圖Fig. A

每個樣本收集10,000-15,000 白細胞。

l  數據評估

通過細胞產生氧化代謝產物的平均熒光強度進行分析。在散點圖 lin FSC/lin SSC中圈定所要檢測細胞群(粒細胞,單核細胞),見英文原版圖Fig.2A-2F。

陰性對照管(tube#1)在FL1坐標軸上設定maker,使1~3%的細胞在陽性區域。

測試管(tube#2/3/4)在marker內的細胞則為的陽性細胞,平均熒光強度和發生氧化的量相關。

5.       注意事項(Remarks

l  肝素化抗凝的全血需要在采集后24 h進行處理,在處理前在室溫條件下保存。

l  可獲得基質的量與基質片溶解在1x洗液中的孵育時間是相關的(20-30 min最佳)。

l  嗜酸性粒細胞(過敏及寄生蟲感染時數量增多)會顯示自體熒光增長,在0°C的陰性對照分析時會被顯示出來。

l  吞噬細胞在37°C的大小和顆粒度會與陰性對照的樣本不同,這一點在圈定細胞區域的時候要注意。另外,細胞可能會由于在37°C條件下的自體溶解或者粘附在塑料表面而丟失減少。

l  在建立試驗方法時,采用重復管是非常有用的。

l  提供的采用大腸桿菌的試驗方法是在最佳條件下(如,全血樣本,調理的大腸桿菌等)考察樣本的氧化爆發活性。在正常人體給藥后進行體內或者體外氧化爆發活性檢測時通常只有一定程度增加。

進行體外試驗檢測藥物作用時,通??蛇x擇低刺激物fMLP或者進行時間依賴性動力學試驗(與大腸桿菌孵育2.5或者5 min)或者稀釋菌液(1:4或者1:8)

l  大腸桿菌已經受調理素的作用過的,但是全血中的血清還會對其有一定的影響。所以當采用除全血樣本以外的樣本,如分離的單核細胞,巨噬細胞或者其他細胞系與大腸桿菌孵育時,孵育體系可加入5-20% 胎牛血清或者人血清。同時也可能有必要延長孵育時間(60 min-240 min)。

6.       其他限制(Limitations

l  每個實驗室需要根據自己實驗條件建立的自己的參考值范圍。

l  樣本需要至少有95%的活細胞且全血樣本需要完全被抗凝。含有衰老的細胞和未完全抗凝的血樣可能導致非特異染色,可能是由于血小板的凝集和死細胞的泄漏的DNA引起的。

l  樣本在未加入DNA染液(REAG G)上流式細胞儀檢測前,在冰上放置1 h是穩定的,但是熒光強度會系統性的丟失。

l  基質DHR123非常容易氧化,所以是在安瓿瓶(含有惰性氣體)存放。

7.       關于進行定量分析的重要的說明(important instruction for quantitative analysis

l  吞噬作用和氧化爆發是主要依賴于溫度,所以在整個樣本處理過程中樣本的溫度,孵育條件的溫度是需要嚴格遵守。溫度計應采用可以顯示小數點后一位的型號。

l  實驗的可重復性和標準化操作是非常重要的,所以需要嚴格按照試劑說明書和自己改動步驟(如果有改動)進行操作。

l  任何流式細胞儀的改動都要考慮,因為這會影響到“Geomean”的值,所以使用校準微球(beads)對流式細胞儀進行每日的校準是非常有必要的。

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