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免疫組化小貼士

更新時間:2013-01-22 09:36:31點擊次數:2652次字號:T|T
1.固定:最好用 4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片,甲醛固定有時比冰凍丙酮好;但對于不同的組織 和抗原,可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液,請于購置前注意說明 書。 Bouin S 固定液:飽和苦味酸 750ml,甲醛 250ml,冰醋酸 50ml,其對組織的穿透力較強,固定較好, 結構完整,但因偏酸,對抗原有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標本的長期保存。 PLP 液:即高碘酸鈉-賴氨酸-...
1.固定:最好用 4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片,甲醛固定有時比冰凍丙酮好;但對于不同的組織
和抗原,可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液,請于購置前注意說明
書。
Bouin S 固定液:飽和苦味酸 750ml,甲醛 250ml,冰醋酸 50ml,其對組織的穿透力較強,固定較好,
結構完整,但因偏酸,對抗原有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標本的長期保存。
PLP 液:即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織,對超微結構及許多
抗原的抗原性保存較好。
2.組織脫水,透明:時間不能太長,否則在切片時容易碎片,切不完整。
3.切片時展片:有些組織在切片后難以在水中展開,這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。
4.烤片:60℃ 30 分鐘或 37℃ 過夜,溫度太高或時間太長,抗原容易丟失。
5.蠟塊及切片的保存:最好在 4℃保存
6.脫片問題: Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑,6ml 的多聚
賴氨酸溶液可按 1:10 稀釋成 60ml 的工作液,適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行,
可用雙重處理(APES 和 Poly-L-Lysine)的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下,可用如下方法:切
片在脫蠟前,放在 APES 1:50 丙酮溶液中浸泡 3 分鐘,晾干,即可進行下一步。
7.滅活內源性酶:HRP 系統:3%雙氧水滅活;AP 系統:3%HAc 滅活。
8.暴露抗原:對于石蠟切片的免疫組化實驗時,必須采用高溫加熱抗原修復,這將有助于暴露抗原決定簇,
從而增加免疫組化染色的強度(不同抗體的最佳修復液請參閱抗體說明書)。對于不同的組織,不同的抗原,
不同的抗體,所采用的方法應不一樣,可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋
白酶消化等。
9.封閉:在山羊血清封閉,非特異性染色仍然較強時,可延長封閉時間或用濃縮血清封閉
10.抗體稀釋:應遵循“現用現配”的原則,對于 PBS 稀釋的抗體一定要當天使用。
11.背景高:在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下,如果背景依舊高,可采用含 1‰ Tween20
的 PBS 洗,特別是在顯色之前要多洗。
12.返藍:在蘇木素復染后,可用堿性緩沖液(如 PBS)或 Na2HPO4的飽和溶液返藍。
13.顯色:一定要在顯微鏡下觀察,注意控制背景。
14.在整個操作過程中,切片千萬不能干燥,否則會有非特異性染色。
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