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石蠟切片免疫組化染色步驟

更新時間:2013-01-22 09:34:13點擊次數:2549次字號:T|T
1、載玻片的處理: 抗原修復過程中,由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響,極易造成脫片。為保證試驗的正常 進行,可選用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等幾種 試劑,對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下: 1.1 APES:現用現配。將洗凈的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀釋的 APES 中,停留 20~30 秒鐘,取出 稍停片刻,再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結...
1、載玻片的處理:
抗原修復過程中,由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響,極易造成脫片。為保證試驗的正常
進行,可選用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip
TM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等幾種
試劑,對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下:
1.1 APES:現用現配。將洗凈的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀釋的 APES 中,停留 20~30 秒鐘,取出
稍停片刻,再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的 APES,置通風櫥中晾干即可。用此載玻片撈片
時應注意組織要一步到位,并盡量減少氣泡的存在,以免影響染色結果。
1.2 Histogrip
TM:將洗凈的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀釋的 Histogrip 液中,停留 1~2 分鐘,然后用雙
蒸水快速清洗三次,室溫干燥或 60
oC 烤箱烘烤一小時,裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine:將洗凈、干燥的載玻片放入以 1:10 比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中,浸泡
5 分鐘,60
oC 烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。
2、常用酶消化:
2.1 胰蛋白酶:一般使用濃度為 0.05%~0.1%,消化時間為 37℃、10~40 分鐘,主要用于細胞內抗原的
顯示。
2.2 胃蛋白酶:一般使用濃度為 0.4%,消化時間為 37℃、30~180 分鐘,主要用于細胞間質抗原的顯示,
如:Laminin(層粘蛋白),Collagen IV(IV 型膠原)等。
2.3 皂素(Saponin):一般使用濃度為 2~10m g/ml 的 saponin 溶液,消化時間為室溫孵育 30 分鐘。
3、抗原熱修復:
可根據實驗室的具體條件,選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復??乖瓱?br /> 修復可選用各種緩沖液,如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等,但實驗證明,以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)
效果最好。請選用我公司提供的 ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液(粉劑)配制,取該粉劑一包溶于 1000ml
的蒸餾水中,混勻,其 pH 值在 6.0 ± 0.1,如因蒸餾水本身造成的 pH 值偏差,請自行調整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法:切片脫蠟至水后,3%H2O2處理 10 分鐘,蒸餾水洗 2 分鐘×
3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在
92℃~98℃之間并持續 10~15 分鐘(注意:無論是使用醫用或家用微波爐,請根據具體機型酌情設置
條件,務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求)。取出容器,室溫冷卻 10~20 分鐘(注意:不可將
切片從緩沖液中取出冷卻,以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型)。PBS 洗,下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法:切片脫蠟至水。將 1500ml~3000ml 的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)
注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上,放入鍋內,使切片位于液面以下,蓋鍋壓閥。
當壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱 5~6 分鐘后),計時 1~2 分鐘,然后將壓力鍋端離熱源,冷水沖至
室溫后,取下氣閥,打開鍋蓋,取出切片,蒸餾水洗后,PBS 洗 2 分鐘×3,下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法:切片脫蠟至水后,放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的
容器中,并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中,電爐上加熱煮沸,從小容器的溫度到 達
92℃~98℃起開始計時 15~20 分鐘,然后端離電爐,室溫冷卻 20~30 分鐘,蒸餾水沖洗,PBS 洗,下
接免疫組化染色步驟。
4、免疫組化染色步驟:
(以美國 ZYMED 公司 SP 試劑盒為例)
4.1 石蠟切片脫蠟至水。
4.2 3%H2O2 室溫孵育 5~10 分鐘,以消除內源性過氧化物酶的活性。
4.3 蒸餾水沖洗,PBS 浸泡 5 分鐘,(如需采用抗原修復,可在此步后進行)。4.4 5~10%正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉,室溫孵育 10 分鐘。傾去血清,勿洗,滴加適當比例稀
釋的一抗或一抗工作液,37℃孵育 1~2 小時或 4℃過夜。
4.5 PBS 沖洗,5 分鐘×3 次。
4.6 滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗(1%BSA-PBS 稀釋),37℃孵育 10~30 分鐘;或滴加第二代
生物素標記二抗工作液,37℃或室溫孵育 10~30 分鐘。
4.7 PBS 沖洗,5 分鐘×3 次。
4.8 滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS 稀釋),37℃孵育 10~30 分鐘;或第二代辣根
酶標記鏈霉卵白素工作液,37℃或室溫孵育 10~30 分鐘。
4.9 PBS 沖洗,5 分鐘×3 次。
4.10 顯色劑顯色(DAB 或 AEC)。
4.11 自來水充分沖洗,復染,封片。
冰凍切片免疫組化染色步驟
冰凍切片 4~8μm,室溫放置 30 分鐘后,入 4℃丙酮固定 10 分鐘,PBS 洗,5 分鐘×3。用 3%過氧化
氫孵育 5~10 分鐘,消除內源性過氧化物酶的活性。PBS 洗,5 分鐘×2。
下接免疫組化染色操作步驟。
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